Природные продуценты антибиотиков

Природные продуценты антибиотиков

Процесс получения антибиотика включает в себя четыре основные стадии (рис. 15.7.23) [145]: получение соответствующего штамма — продуцента антибиотика, пригодного для промышленного производства; биосинтез антибиотика; выделение и очистка антибиотика; концентрирование, стабилизация антибиотика и получение готового продукта.

Рис. 15.7.23. Схема производства антибиотиков в процессе микробного биосинтеза

Получение продуцентов антибиотических веществ [145]

Первая задача при поиске продуцентов антибиотиков — выделение их из природных источников. Вместе с тем для этих целей широко применяется метод изменения генома выделенного продуцента антибиотика путем мутагенеза и генной инженерии.

В основу большинства приемов выделения продуцентов положен принцип выделения чистой культуры микроба и непосредственного испытания его по отношению к используемым тест-организмам.

Большинство сапрофитных бактерий хорошо развивается на богатых по составу натуральных средах (мясопептонный агар, картофельный агар, сусло-агар и др.) при рН около 7,0 и температуре 30–37 °С. В этих же условиях развиваются актиномицеты и некоторые грибы, но для них они менее благоприятны, чем для бактерий.

Актиномицеты растут медленнее, чем бактерии; они могут использовать такие источники питания, которые не очень хорошо усваиваются бактериями. Для выделения актиномицетов рекомендуются среды, приведенные в табл. 15.7.112. Значение рН среды после стерилизации устанавливается в пределах 6,8–7,1.

Мицелиальные грибы предпочтительнее развиваются на средах с несколько пониженным значением рН (4,5–5,0), на которых плохо растут многие бактерии и актиномицеты. Для выделения мицелиальных грибов можно рекомендовать среды, приведенные в табл. 15.7.113.

Таблица 15.7.112

Состав питательных сред, рекомендуемых для выделения актиномицетов [145]

Среда 1 Среда 2 Среда 3 1)
Компоненты Количество, г Компоненты Количество, г Компоненты Количество, г
SO4 1 KNO3 1 NaCl 5
K2HPO4 1 K2HPO4 3 CaCl2 0,5
NaCl 1 NaCl 0,2 Пептон 5
MgSO4 1 MgCO3 0,3 Кукурузный экстракт 5 мл
Крахмал 10 FeSO4 0,001 Глюкоза 10
Агар-агар 15 CaCO3 0,5 Агар-агар 15
Вода 2) 1000 Крахмал 10 Вода 2) 1000
Агар-агар 15
Вода 2) 1000

Таблица 15.7.113

Состав питательных сред, рекомендуемых для выделения мицелиальных грибов [145]

Среда 1 Среда 2
Компоненты Массовая доля, масс. % Компоненты Массовая доля, масс. %
Глюкоза 2 Глюкоза 1
Сахароза 2 Сахароза 1
Кукурузный экстракт (СВ) 0,1 Перевар Хоттингера 4
NH4NO3 0,02 K2HPO4 0,05
K2HPO4 0,1 MgSO4 × 7H2O 0,05
MgSO4 × 7H2O 0,05 ZnSO4 0,001
ZnSO4 0,01 FeSO4 0,001
FeSO4 0,001

Влияние условий культивирования на биосинтез антибиотиков [145]

К числу наиболее существенных факторов, оказывающих влияние на проявление антибиотических свойств микроорганизмов, относятся состав среды, ее активная кислотность, окислительно-восстановительные условия, температура культивирования, методы совместного выращивания двух или большего числа микроорганизмов и другие факторы.

Среды для культивирования микроорганизмов. Натуральные (комплексные) среды, состоящие из природных соединений и имеющие неопределенный химический состав (части зеленых растений, животные ткани, солод, дрожжи, фрукты, овощи, навоз, почва и т. д.), содержат все компоненты, необходимые для роста и развития микроорганизмов большинства видов. Используются следующие среды:

  • мясопептонная среда, в состав которой одновременно с мясным экстрактом и пептоном входят хлорид натрия, фосфат калия, иногда глюкоза или сахароза; используется обычно в лабораторной практике;
  • картофельные среды с глюкозой и пептоном, часто используемые в лаборатории для культивирования многих видов актиномицетов и бактерий;
  • среды с кукурузным экстрактом, соевой мукой, бардой и другими веществами, в состав которых входят сульфат аммония, карбонат кальция, фосфаты, глюкоза, сахароза, лактоза или иные углеводы и ряд других соединений; среды успешно применяются в промышленности, т. к. являются дешевыми и обеспечивают хорошее развитие микроорганизмов с высоким выходом антибиотиков.

Поскольку натуральные среды не позволяют получать строгие количественные данные для изучения физиологических и биохимических особенностей организма, применяют синтетические среды, которые подбирают для отдельных продуцентов индивидуально. Синтетические среды могут быть как относительно простыми, так и сложными, для составления которых используют методы математического планирования эксперимента.

Источниками углерода могут быть органические кислоты, спирты, углеводы, сочетания различных углеродсодержащих соединений (табл. 15.7.114).

Таблица 15.7.114

Влияние источника углерода на рост B. brevis subsp. G.B.
и биосинтез грамицидина (48 ч культивирования) [145]

Источник углерода Антибиотик, мкг/мл Биомасса, мг/100 мл
Глюкоза 300 220
Галактоза 250 300
Мальтоза 250 250
Сахароза 140
Лактоза 160
Крахмал 250 160
Глицерин 1000 460
Маннит 100
Этанол 12
Янтарная кислота 350 180
Пировиноградная кислота 95
Уксусная кислота 25 80
Молочная кислота 250 160

При промышленном получении ряда антибиотиков в качестве источников углерода нередко применяют картофельный крахмал, кукурузную муку или другие растительные материалы. Однако не все продуценты обладают достаточно активными амилазами, способными осуществлять гидролиз крахмалсодержащего сырья. Предварительное осахаривание крахмалсодержащих материалов с помощью ферментов значительно облегчает использование микроорганизмами этих материалов.

Читайте также:  Помогает ли черноплодная рябина от давления

Источники азота оказывают большое влияние на образование микроорганизмами антибиотических веществ. Обычно в средах для культивирования микроорганизмов источником азота служат соли азотной (реже азотистой) кислоты, аммонийные соли органических и неорганических кислот, аминокислоты, белки и продукты их гидролиза. Многие микроорганизмы успешно используют и окисленные формы азота, некоторые из них нуждаются именно в нитратном источнике азота (Streptomyces auranticus, S. subtropicus и некоторые другие). Ряд актиномицетов иногда усваивают лучше нитраты, чем аммонийные соли; они могут использовать даже нитриты, если их вносят в среду в небольших количествах (не более 50 мг NaNO2 / 1 л среды). При этом усвоение нитритов тесно связано с источником углерода; например в присутствии глицерина нитриты потребляются гораздо лучше, чем в присутствии глюкозы. Использование аммония и некоторых органических источников азота плесневыми грибами улучшается в присутствии небольших количеств (0,1–0,2 %) некоторых дикарбоновых (янтарной и фумаровой) кислот. В ряде случаев для накопления антибиотика необходимо присутствие и аммонийного, и нитратного источника азота (биосинтез пенициллина).

Обычно наиболее благоприятным для микроорганизмов является соотношение C : N = 20. Однако для образования антибиотика такое соотношение не всегда оптимально. Поэтому для каждого продуцента необходимо подбирать соответствующее соотношение углерода и азота.

Источниками минерального питания служат фосфор, сера и другие макро- и микроэлементы.

Большинство микроорганизмов легко используют в качестве источников фосфора ортофосфаты. Отдельные виды наряду с этим потребляют и фитаты (соли инозитфосфорных кислот).

Продуценты антибиотиков по отношению к концентрации фосфора в среде можно разделить на три группы:

  • высокочувствительные продуценты, для которых оптимальная концентрация фосфора в среде составляет менее 0,01 % (продуценты нистатина, тетрациклинов, флоримицина, ванкомицина);
  • продуценты средней чувствительности, для которых оптимальная концентрация фосфора составляет 0,010–0,015 % (продуценты стрептомицина, эритромицина, циклосерина, неомицина);
  • малочувствительные продуценты, для которых оптимальная концентрация фосфора составляет 0,018–0,020 % (продуценты новобиоцина, грамицидина, олеандомицина).

Сера входит в состав некоторых антибиотиков, образуемых грибами (пенициллин, цефалоспорин, глиотоксин и др.), бактериями (бацитрацины, субтилины, низины) и актиномицетами (эхиномицины, группа тиострептона). Обычно источником серы в среде служат сульфаты. Однако при биосинтезе пенициллина лучшим источником серы для продуцента служит тиосульфат натрия.

Кроме того, для биосинтеза антибиотиков необходимы и отдельные микроэлементы. Так, продуцент альбомицина S. subtropicus образует антибиотик при значительной концентрации железа в среде. Железо необходимо для образования хлорамфеникола и других антибиотиков.

Биосинтезу ряда антибиотических веществ (хлорамфеникола, стрептомицина, пенициллина и др.) способствуют ионы цинка.

Стимулирующее влияние на биосинтез гентамицина, курамицина А, фософономицина оказывают ионы кобальта.

Ионы галогенов входят в состав некоторых тетрациклиновых антибиотиков и хлорамфеникола.

Влияние рН среды. Многие бактериальные организмы, синтезирующие антибиотики, лучше развиваются при рН около 7,0, хотя некоторые, например молочнокислые стрептококки, продуцирующие низин, лучше развиваются в среде при рН = 5,5÷6,0.

Большинство актиномицетов хорошо развиваются при начальных значениях рН среды в пределах от 6,7 до 7,8; в большинстве случаев жизнеспособность актиномицетов при рН ниже 4,0–4,5 подавлена.

Температура. Для большинства бактериальных организмов температурный оптимум развития лежит в диапазоне 30–37 °С. Для продуцента грамицидина С (B. brevis) оптимальная температура для развития и биосинтеза равна 40 °С.

Актиномицеты, как правило, культивируются при температуре 26–30 °С, хотя некоторые виды стрептомицетов могут развиваться как при пониженных (от 0 до 18 °С), так и при повышенных (55–60 °С) температурах.

Для большинства мицелиальных грибов оптимальная температура составляет 25–28 °С.

Аэрация. Большинство изученных продуцентов антибиотиков являются аэробами. Для биосинтеза многих антибиотиков (пенициллин, стрептомицин и др.) максимальное их накопление происходит при степени аэрации, равной единице, при которой через определенный объем среды за 1 мин продувается такой же объем воздуха.

В процессе развития продуцента антибиотика в промышленных условиях потребность организма в кислороде меняется в зависимости от стадии развития, вязкости КЖ и других факторов. На определенных стадиях могут возникнуть ситуации, связанные с кислородным голоданием продуцента. В этих условиях следует принимать дополнительные меры, например, повышение концентрации окислителя добавлением пероксида водорода.

Стадии развития продуцентов [145]

В условиях глубинной культуры процесс развития организма и синтеза антибиотика проходит в две фазы.

В первой фазе развития культуры или, как ее иногда называют, тропофазе (фаза сбалансированного роста микроорганизма), наблюдается интенсивное накопление биомассы продуцента, связанное с быстрым потреблением основных компонентов среды и с высоким уровнем поглощения кислорода.

Во второй фазе развития, именуемой идиофазой (фаза несбалансированного роста микроорганизма), накопление биомассы замедлено или даже уменьшено. В этот период продукты метаболизма микроорганизма лишь частично используются на построение клеточного материала, они в основном направляются на биосинтез антибиотика. Обычно максимум продукции антибиотика в среде наступает после максимума накопления биомассы.

Читайте также:  Антибиотики при тромбоцитопении какие можно

Интенсифицировать антибиотикообразование можно путем совместного культивирования продуцента антибиотика с другими специально подобранными видами микроорганизмов.

В частности, штаммы продуцента трихотецина (Trichothecium roseum) наибольшую биологическую активность проявляют при совместном развитии с микроскопическими грибами рода Penicillium; выход антибиотика повышается в этом случае в несколько раз.

Увеличение образования бацитрацина происходит в том случае, если продуцент антибиотика B. subtilis культивируется совместно с Pseudomonas sp.

Повышение биосинтеза леворина культурой S. levoris наблюдается при совместном культивировании актиномицета с дрожжеподобным грибом Candida tropicalis.

При совместном культивировании двух мутантных штаммов Streptomyces noursei, потерявших способность к биосинтезу нистатина, антибиотик образуется в том же количестве, что и при развитии исходного активного штамма (табл. 15.7.115).

Таблица 15.7.115

Образование нистатина при совместном выращивании двух неактивных штаммов St. noursei (4-е сутки) [145]

Штамм актиномицета Образование нистатина
В культуральной жидкости, ед./мл В мицелии, ед./мг
Штамм № 149
Штамм № 368
Штамм № 149 + штамм № 368 310 100
Исходный штамм актиномицета (контроль) 350 80

Методы культивирования продуцентов антибиотиков. Наиболее перспективным методом выращивания микроорганизмов — продуцентов антибиотиков признан метод глубинного культивирования с использованием периодических процессов.

Выделение и химическая очистка антибиотиков [145]

В зависимости от того, где сосредоточено антибиотическое вещество, применяют соответствующие методы его извлечения.

Если антибиотик находится в КЖ, его выделяют методами экстракции, используя для этого не смешивающийся с водой растворитель, осаждают в виде нерастворимого соединения или сорбируют ионитами.

Из клеток микроорганизмов антибиотик выделяют экстрагированием органическими растворителями. Если антибиотик содержится и в КЖ, и в клетках продуцента, то сначала его переводят в фазу, из которой наиболее целесообразно извлекать целевое вещество.

Отделение раствора от биомассы и взвешенных частиц проводят методами фильтрации или центрифугирования.

Очистка антибиотика (отделение от примесей) осуществляется методами экстракции, ионообменной сорбции и осаждения. После химической очистки антибиотик высушивают, для чего применяют лиофильную сушку, высушивание в распылительной сушилке, высушивание во взвешенном слое или в вакуум-сушильных аппаратах

Учебник представляет собой систематизированное изложение основных разделов дисциплин «Антибиотики» и «Методы определения антибиотикопродукции и антибиотикочувствительных микроорганизмов» в полном соответствии с Федеральным государственным образовательным стандартом. Учебник рекомендован для студентов медицинских и биологических направлений и специальностей при изучении дисциплин: микробиология, физиология роста микроорганизмов, антибиотики, методы определения антибиотикопродукции и антибиотикочувствительных микроорганизмов, иммунология, промышленная микробиология и биотехнология, введение в биотехнологию, а также может быть использован в качестве основной литературы при написании курсовой работы по дисциплине антибиотики и в качестве справочного материала при выполнении экспериментальной части дипломного проекта.

Оглавление

  • Введение
  • Обозначения и сокращения
  • Термины, используемые в учебном пособии
  • 1 История развития науки – Антибиотики
  • 2 Взаимоотношения микроорганизмов в естественных условиях
  • 3 Выделение продуцентов антибиотических веществ и методы определения их биологического действия

Приведённый ознакомительный фрагмент книги Антибиотики и химиотерапевтические препараты предоставлен нашим книжным партнёром — компанией ЛитРес.

Поиск определенных последовательностей ДНК в метагеномах 2000 образцов почвы, собранных на территории США, помог обнаружить генный кластер, ответственный за синтез антибиотиков, активных против лекарственно устойчивых бактерий. Новые антибиотики назвали малацидинами.

© Wannapa Thanabunwanich / Dreamstime.com

© Wannapa Thanabunwanich / Dreamstime.com

Неизвестных науке бактерий намного больше, чем известных: лишь малая доля микроорганизмов «соглашается» расти в лаборатории, на готовых средах, а все прочие до недавнего времени оставались неизученными. Однако современные методы анализа ДНК изменили ситуацию. Сегодня микроорганизмы не обязательно культивировать — можно начинать изучение биоразнообразия непосредственно в пробах. Такие исследования имеют большую прикладную значимость: бактериальная «темная материя» — потенциальный источник новых антибиотиков.

Перспективными для борьбы против инфекций с множественной лекарственной устойчивостью представляются кальций-зависимые антибиотики — небольшое семейство N-ацилированных циклических пептидов, которые для антибактериальной активности нуждаются в кальции. Они содержат консервативный мотив Asp-X-Asp-Gly, который, как считается, облегчает связывание кальция. К этому семейству принадлежит, например, даптомицин — его назначают при лекарственно-устойчивой бактериемии и других осложненных инфекциях.

Исследователи из Рокфеллеровского университета под руководством Шона Брэди искали в метагеномах образцов из окружающей среды такие гены, которые могут быть вовлечены в синтез кальций-зависимых антибиотиков. «Хотя методы обнаружения антибиотиков на основе метагенома все еще находятся в зачаточном состоянии, масштабирование и автоматизация описанной здесь методологии должны сделать возможным систематическое нахождение в глобальном метагеноме [природных] антибиотиков, которые до сих пор оставались скрытыми», — говорится в статье, опубликованной 12 февраля в Nature Microbiology.

Читайте также:  Картинки с бикини дизайном

Шон Брэди и его коллеги выделили ДНК из 2000 уникальных образцов почвы, собранных практически со всей территории США. Для амплификации они использовали вырожденные ПЦР-праймеры, ориентированные на консервативные области генов, продукты которых обеспечивают синтез кальций-зависимых антибиотиков. В частности, они планировали найти аденилирующие домены (отвечающие за присоединение АМФ к белкам) нерибосомных пептидсинтетаз. Полученные ампликоны проанализировали с помощью биоинформатической платформы Environmental Surveyor of Natural PRODUCTS Diversity (eSNaPD).

Три четверти почвенных проб содержали метки, которые соответствовали по меньшей мере одному известному домену аденилирования. Это сколько же потенциальных антибиотиков! (Рис. в статье.)

Затем авторы работы построили филогенетическое древо, основанное на обнаруженных последовательностях домена аденилирования, и увидели клады («ветви» дерева), обособленные от известных последовательностей. Можно было предположить, что эти гены принадлежат продуцентам других кальций-зависимых антибиотиков, пока еще не охарактеризованных. Один перспективный вариант обнаруживался в 19% метагеномов — то есть очень многие почвенные бактерии синтезируют некое неизвестное нам семейство антибиотиков. Эти антибиотики действительно были открыты и получили название «малацидины» (metagenomic acidic lipopeptide antibiotic-cidins).

Чтобы доказать существование малацидинов, прежде всего надо было собрать из фрагментов ДНК полный кластер генов, продукты которых отвечают за биосинтез антибиотика. Авторы работы нашли фрагменты этого кластера в библиотеке, собрали их в дрожжевой клетке с использованием метода TAR (transformation-associated recombination) и получили искусственную бактериальную хромосому, несущую полный кластер, которую внедрили в клетку Streptomyces albus. И действительно, S. albus стал производить антибиотик — экстракт его культуры подавлял развитие золотистого стафилококка и содержал метаболиты, которые были названы малацидинами А и В.

Структуру этих соединений установили с помощью масс-спектрометрии и ЯМР-анализа. Малацидины представляют собой 10-членные циклические липопептиды. Интересно, что хотя кальций им необходим для антибактериальной активности, у них нет канонических кальций-связывающих доменов.

Структура малацидинов А и В — представителей нового семейства антибиотиков. (Группа R в случае А метильная, в случае В — этиловая.) Звездочками отмечены стереоцентры, предсказанные биоинформатическими методами. Разноцветными буквами подписаны гены бактериального кластера, обеспечивающие синтез того или иного фрагмента молекулы. Сиреневым обведен остаток редкой 3-гидроксиласпарагиновой кислоты

Малацидины оказались активными против грамположительных бактерий, в том числе патогенов с множественной устойчивостью. В экспериментах на крысах авторы работы обнаружили, что местное применение малацидина А обеззараживает рану, инфицированную метициллинрезистентным Staphylococcus aureus. Они также попытались вызвать у стафилококка резистентность к малацидину, подвергая его сублетальным уровням антибиотика. Но даже через 20 дней резистентности не наблюдалось.

Известно, что другие кальций-зависимые антибиотики влияют на синтез липидной мембраны или клеточной стенки бактерий. Однако малацидины не нарушают целостность мембраны — по-видимому, они повреждают клеточную стенку иным способом.

Современные технологии не в первый раз демонстрируют свои возможности в поиске новых антибиотиков. В 2015 году сотрудники компании Novobiotic Pharmaceuticals нашли почвенную бактерию, которая синтезировала антибиотик теиксобактин (Losee L. Ling et al. // A new antibiotic kills pathogens without detectable resistance. // Nature, 2015, 517, 455—459, DOI: 10.1038/nature14098). Это была первая такая находка за много лет; предыдущий микроорганизм — производитель антибиотика был обнаружен в природе еще в 80-е годы ХХ века. Бактерии дали предварительное название Eleftheria terrae (оно отражает нежелание этого вольного существа расти в культуре: «элефтерия» по-гречески означает «свобода»). Изолировать ее позволила остроумная разработка исследователей из Северо-Западного университета — iChip, от isolation chip technique: пластиковый блок с лунками, заполненными питательной средой, в который вносится раствор образца с таким расчетом, чтобы в каждой лунке оказалось не более одной бактерии. Затем чип затягивают полупроницаемой мембраной и помещают обратно в почву. Все вещества, которых нет в готовой среде, но которые необходимы бактерии, попадают в лунку через мембрану, таким образом проблему некультивируемости удается решить. Изучение теиксобактина сейчас продолжается, пытаются, например, получить его синтетические аналоги.

А в 2016 году бактерию — продуцента антибиотика обнаружили в микробиоме человеческого носа (Zipperer A. et al. // Human commensals producing a novel antibiotic impair pathogen colonization. // Nature, 2016, 535, 511—516, DOI:10.1038/nature18634). Ничего странного в этом нет: в нашем организме обитает множество микроорганизмов, и они так же конкурируют друг с другом и применяют против конкурентов «химическое оружие», как и обитатели почвы.

Bradley M. Hover et al. // Culture-independent discovery of the malacidins as calcium-dependent antibiotics with activity against multidrug-resistant Gram-positive pathogens. // Nature Microbiology (2018). DOI: 10.1038/s41564-018-0110-1

Ссылка на основную публикацию
Припухлость над коленной чашечкой
девочки, я даже не знаю куда (на какой форум) написать, я в панике, муж приехал, забрал полис омс и поехал...
Приливы к голове при всд и остеохондрозе
Вегето-сосудистая дистония – это заболевание, которое по своим признакам напоминает остеохондроз, но вызывается оно совсем другими причинами. Изменения в шейном...
Приливы при климаксе что это такое и как облегчить состояние отзывы
Сегодня женская тема – приливы жара при климаксе. Одним из характерных явлений во время этого периода жизни женщины являются внезапные...
Природная борная кислота
Борная кислота Б о рная кислот а , ортоборная кислота, H3BO3, слабая неорганическая трехосновная кислота; бесцветные кристаллы в виде чешуек,...
Adblock detector